ردیابی سریع و دقیق قارچ rosellinia necatrix از خاک و ریشه گیاهان با استفاده از روشهای کلاسیک و آغازگرهای اختصاصی

چکیده بیماری پوسیدگی سفید ریشه یکی از مهمترین بیماریهای درختان میوه در دنیا و ایران می باشد که توسط قارچ rosellenia necatrix ایجاد می شود. علیرغم وقوع این بیماری در بیش از 170 گونه گیاهی، خسارت وارده از آن به صورت پژمردگی و مرگ درختان میوه هسته دار و دانه دار از اهمیت خاصی برخوردار است. به دلیل پایداری طولانی مدت قارچ عامل بیماری در خاک، مقاومت به خشکی، تحمل به دامنه های مختلف ph، دامنه میزبانی بالا ، نفوذ به اعماق خاک و مقاومت نسبت به قارچکش های مختلف، کنترل بیماری پوسیدگی سفید ریشه بسیار پیچیده و مشکل می باشد. بنابراین بهترین شیوه مدیریت بیماری، پیش گیری ازوقوع آن با استفاده از نهال های سالم و کشت گیاهان در زمین های عاری از عامل بیماری است. برای رسیدن به چنین هدفی، ضروری است امکان آلودگی خاک نهالستان ها و باغ ها به قارچ r. necatrix بررسی شود تا از گسترش بیماری جلوگیری گردد. دستیابی به یک روش ساده و حساس به منظور ردیابی بیمارگر در خاک و ریشه نهال ها ضروری است که هدف اصلی این پژوهش بود. در این پژوهش 18 جدایه r. necatrix از ریشه درختان میوه آلباو و سیب جداسازی و خالص سازی گردید و با استفاده از آغازگر های اختصاصی گونه در واکنش pcr، مورد تایید نهایی قرار گرفت. به منظور بررسی تنوع ژنتیکی بین جدایه ها از تکنیک pcr-rflp استفاده گردید. نتایج هضم آنزیمی قطعه 500 جفت بازی تکثیر شده از ناحیه its جدایه ها با سه آنزیم برشی mboi، mspi و hinfi مشخص نمود که جدایه ها یکنواختی ژنتیکی دارند. به منظور تعیین مناسب ترین روش جهت ردیابی قارچ عامل بیماری از ریشه و خاک از روش های کشت مستقیم خاک و ریشه آلوده در محیط کشت، nested pcr، و به دام انداختن ( trapping) بیمارگر با شاخه های گیاهان میزبان استفاده شد. از بین روشهای مورد استفاده، روش کشت مستقیم از خاک به دلیل عدم حساسیت لازم برای ردیابی بیمارگر،مناسب تشخیص داده نشد، ولی سایر روشها قادر به ردیابی بیمارگر بودند، که در بین آنها روش nested pcr بهتر ارزیابی گردید. بررسی رابطه بین میزان اولیه مایه تلقیح و مدت زمان لازم جهت ردیابی عامل بیماری و بروز علائم نشان داد که با افزایش جمعیت مایه تلقیح، مدت زمان لازم جهت ردیابی و بروز علائم بیماری کاهش می یابد. به منظور تایید صحت ردیابی قارچ مورد نظر از خاک، توالی ناحیه its جدایه مورد آزمایش همسانه سازی و تعیین توالی نوکلئوتیدی شد. نتایج همردیف سازی توالی مورد نظر با توالی r. necatrix ثبت شده موجود در genbank نشان داد که جدایه اصفهان حداکثر شباهت (99/98%) را با جدایه شناخته شده r. necatrix دارد. این موضوع دلیلی بر صحت ردیابی بیمارگر از خاک به روش pcr بود. در تعیین میزان حساسیت ردیابی با تکنیک nested pcr مشخص شد که با این روش می توان عامل بیماری رادر غلظت fg/µl1 ردیابی نمود که از حساسیت بیشتری نسبت به روش pcr مستقیم با توانایی ردیابی pg/µl10 از عامل بیماری برخوردار است. به این ترتیب، روش nested pcr به دلیل دقت ،حساسیت و سرعت عمل زیاد، روش مناسب تری نسبت به سایر روش ها برای ردیابی قارچ r. necatrix در خاک تشخیص داده شد. واژهای کلیدی: ردیابی، پوسیدگی سفید ریشه، rosellenia necatrixو nested pcr